最近在qPCR仪的使用过程中

经常会有小伙伴有一些疑问

 1 、我的实验数据是否可靠？

 2 、实验结束了，

我应该关注哪些数据和图像，

才符合要求？

 3 、数据和曲线有什么关系，

两个不同步，

数据能不能用？

等等问题。。。。

那我们接下来就跟小伙伴们一起探讨一下吧。

常规我们需要关注的有

01  Ct值

首当其冲的就是CT值：Ct值，也称为循环阈值，它表示样品反应超过荧光阈值的循环数，表明目标核酸的检测结果。Ct值越低表示目标序列初始量越大。影响Ct值大小的因素有很多，实验过程中需要控制这些因素保证Ct值的准确性和真实性。Delta-Delta Cq这种标准化的方法，通过引入内参基因，可以将生物反馈变化带来的目标序列真实浓度变化与技术操作问题区分开。

Tips：Ct值的不同术语

Ct – cycle threshold/threshold cycle（循环阈值）

Cp – crossing point（交叉点）

TOP – take-off point（起点）

Cq – quantification cycle（量化循环数）

以上这些词都是表示的Ct值，只是名称不同而已。为了标准化qPCR命名法，MIQE（minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments）指南建议使用Cq值。）

通常情况下，我们依据以下标准来评估 Cq 值的结果：

• 优秀：内参基因的 Cq 值在 14-18 之间，目的基因的 Cq 值也应在 14-18 之间。

• 良好：内参基因的 Cq 值在 12-20 之间，而目的基因的 Cq 值应在 14-32 之间。

• 一般：内参基因的 Cq 值在 10-22 之间，同时目的基因的 Cq 值则应在 14-35 之间。然而，若目的基因的 Cq 值超过 35，虽然仍然可以使用这些数据，但可能会对实验结果的准确性产生影响，导致结果的偏差较大。所以，若发现 Cq 值偏高，建议重新进行实验以确保结果的准确性。

02 熔解曲线

除了我们上面说到的Cq值以外，我们常规还要关注的一个东西，那就是熔解曲线。为了保证实验结果准确可靠。

我们在检查熔解曲线时，就需要关注以下几个方面：

• 熔点(TM值)：熔点应该位于75-90℃之间，这是一个比较合适的范围。

• 峰型：峰型应该是单峰的，不应该存在任何杂峰。

• 峰距：在理想情况下，峰距应该在5个TM单位内，这样可以确保实验结果的准确性和可靠性。

（图片来自Archimed X4 实验数据）

熔解曲线的解读：根据我们的引物设计原则，扩增产物长度在80-300bp范围，那么熔解温度应该是在80℃-90℃之间。

所以，如果在80℃-90℃之间出现唯一主峰，说明荧光定量PCR完美；如果在80℃-90℃之间出现主峰，80℃以下出现杂峰，基本考虑引物二聚体，可尝试提高退火温度解决；如果在80℃-90℃之间出现主峰，温度上升又出现杂峰，基本上考虑有DNA污染，需要在实验初始阶段去除DNA。

03 扩增曲线

一个标准的扩增曲线，曲线形态应该接近S型。

（图片来自Archimed X4 实验数据）

• 平台期：需要观察曲线是否有明显的平台期。平台期的清晰度对于结果的准确性和可靠性至关重要。浓度较低的情况下，可能没有明显的平台期。

• 二次扩增：应观察曲线是否出现二次抬头的情况，正常曲线不应该在扩增过程中再次上升。若出现二次扩增，则会影响我们对扩增过程的准确理解，因此需要特别注意。

Tips：扩增曲线常识

(1)  扩增曲线：平滑的S型曲线。

(2)  Ct值在15-35范围内。

(3)  没有平台期数据也可用。

(4)  基线通常在3-15个循环。

(5)  Ct值超过35需要判断数据的可靠性。

(6)  技术性重复3个，重复的Cq值的差异不超过0.5。

04 标准曲线

上面三个点基本上已经能够满足我们常规判定qPCR实验数据是否符合我们要求了，但还有额外的一个东西，可能有些小伙伴会遇到，那就是:标准曲线。    在医药方面的应用上，很多小伙伴都会用到标准曲线的构建。

标准曲线的构建过程大致分为：

(1) 样本准备: 选择一系列已知浓度的核酸样本(如DNA或RNA)，这些样本的浓度应在实验预期的浓度范围内，并且尽可能接近将用于实验的样本。

(2) qPCR扩增：对这些不同浓度的样本进行qPCR扩增，记录每个样本的扩增过程。

(3)数据分析: 以初始模板拷贝数的对数值为X轴，以Cq值为Y轴，绘制结果曲线。这条曲线就是qPCR的标准曲线。

（图片来自Archimed X4 实验数据）

标准曲线的好与坏判定标准：

(1)  线性的标准曲线(R2＞0.980或R大于|-0.990|)。

(2)  扩增效率(90~110%)。

(3)  斜率范围 -3.58~-3.10。

(4)  至少有3个技术性重复。

通过我们上述四点

基本上能满足我们

对于实验数据的可靠性判定了 

当然

一次优秀的实验结果呈现

除了实验操作的准确无误外

还取决于优秀实验设备的选择

比如

鲲鹏基因Archimed系列qPCR仪

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